國家衛(wèi)健委印發(fā) 新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南（第五版）
2020-03-13 15:37:51點擊：
國家衛(wèi)健委印發(fā) 新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南（第五版）
為指導(dǎo)各級疾控部門和其他相關(guān)機(jī)構(gòu)開展新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測工
作，特制定本技術(shù)指南。
一、標(biāo)本采集
（一）采集對象。
新型冠狀病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，需要進(jìn)行新型冠狀病毒感染診斷
或鑒別診斷者，或其他需要進(jìn)一步篩查檢測的環(huán)境或生物材料。
(二)標(biāo)本采集要求。
1．從事新型冠狀病毒檢測標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)（培訓(xùn)合格）
和具備相應(yīng)的實驗技能。采樣人員個人防護(hù)裝備（Personal Protective Equipment，
PPE）要求：N95 及以上防護(hù)口罩、護(hù)目鏡、連體防護(hù)服、雙層乳膠手套、防水
靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應(yīng)及時更換外層乳膠手套。
2．住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院的醫(yī)護(hù)人員采集。
3．密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)刂付ǖ募部貦C(jī)構(gòu)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。
4．根據(jù)實驗室檢測工作的需要，可結(jié)合病程多次采樣。
（三）采集標(biāo)本種類。
每個病例必須采集急性期呼吸道標(biāo)本（包括上呼吸道標(biāo)本或下呼吸道標(biāo)本），
重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本；根據(jù)臨床需要可留取便標(biāo)本、全血標(biāo)本、血清
標(biāo)本。
標(biāo)本種類：
1．上呼吸道標(biāo)本：包括鼻咽拭子、咽拭子等。2．下呼吸道標(biāo)本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等。
3．便標(biāo)本：留取糞便標(biāo)本約 10 克（花生大�。�，如果不便于留取便標(biāo)本，可采
集肛拭子。
4．血液標(biāo)本：盡量釆集發(fā)病后 7 天內(nèi)的急性期抗凝血，采集量 5ml,建議使用含
有 EDTA 抗凝劑的真空釆血管采集血液。
5．血清標(biāo)本：盡量釆集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在
發(fā)病后 7 天內(nèi)）釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第 3～4 周釆集。采集量 5ml，建議
使用無抗凝劑的真空釆血管。血清標(biāo)本主要用于抗體的測定，不進(jìn)行核酸檢測。
（四）標(biāo)本采集和處理。
1．鼻咽拭子：采樣人員一手輕扶被采集人員的頭部，一手執(zhí)拭子，拭子貼鼻孔
進(jìn)入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，不可用力過猛，以免發(fā)
生外傷出血。待拭子頂端到達(dá)鼻咽腔后壁時，輕輕旋轉(zhuǎn)一周（如遇反射性咳嗽，
應(yīng)停留片刻），然后緩緩取出拭子，將拭子頭浸入含 2～3ml 病毒保存液（也可使
用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。
2．咽拭子：被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水
中濕潤(禁止將拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起過敏)，被采集人員頭部
微仰，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側(cè)咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者
兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少 3 次，然后再在咽后壁上下擦拭至少 3 次，
將拭子頭浸入含 2～3ml 病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸
鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。咽拭子也可與鼻咽拭子放置于同一管
中。
3．鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集
器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用 3ml 采樣液沖洗收集器 1 次（亦可用
小兒導(dǎo)尿管接在 50ml 注射器上來替代收集器）。
4．深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含 3ml 采樣液的 50ml 螺口
塑料管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測前，加入 2～3ml 采樣液，或
加入痰液等體積的痰消化液。
痰消化液儲存液配方：
成分 每瓶
二硫蘇糖醇 0.1g
氯化鈉 0.78g
氯化磷 0.02g
磷酸氫二鈉 0.112g
磷酸二氫鉀 0.02g
水 7.5ml
pH7.4±0.2 （25℃）
臨用前將儲存液以去離子水稀釋至 100 ml。
也可以采用痰液等體積的含 1g/L 蛋白酶 K 的磷酸鹽緩沖液將痰液化。
5．支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約 30cm 深處），
注入 5ml 生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，
并用采樣液沖洗收集器 1 次（亦可用小兒導(dǎo)尿管接在 50ml 注射器上來替代收集）。
6．肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經(jīng)過咽部插入右肺中葉
或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管分支開口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次 30～50ml，總量 100～250ml，不應(yīng)超過 300ml。
7．糞便標(biāo)本：取 1ml 標(biāo)本處理液，挑取黃豆粒大小的便標(biāo)本加至管中，輕輕吹
吸 3-5 次，室溫靜置 10 分鐘，以 8000 rpm 離心 5 分鐘，吸取上清液進(jìn)行檢測。
糞便標(biāo)本處理液可自行配制：1.211 g Tris，8.5 g 氯化鈉，1.1 g 無水氯化鈣或 1.47
g 含結(jié)晶水的氯化鈣，溶解至 800 ml 去離子水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié) pH 為 7.5，以去
離子水補充至 1000 ml。也可使用 HANK’S 液或其它等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或
磷酸鹽緩沖液溶解便標(biāo)本制備便懸液。如患者出現(xiàn)腹瀉癥狀，則留取糞便標(biāo)本 3～
5ml，輕輕吹打混勻后，以 8000 rpm 離心 5 分鐘，吸取上清液備用。
7. 肛拭子：用消毒棉拭子輕輕插入肛門 3～5cm，再輕輕旋轉(zhuǎn)拔出，立即放入含
有 3～5ml 病毒保存液的 15ml 外螺旋蓋采樣管中，棄去尾部，旋緊管蓋。
8．血液標(biāo)本：建議使用含有 EDTA 抗凝劑的真空釆血管采集血液標(biāo)本 5ml，根
據(jù)所選用核酸提取試劑的類型確定以全血或血漿進(jìn)行核酸提取。如需分離血漿，
將全血 1500～2000rpm 離心 10 分鐘，收集上清于無菌螺口塑料管中。
9．血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本 5ml，室溫靜置 30 分鐘，1500～
2000rpm 離心 10 分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。
其他材料：依據(jù)設(shè)計需求規(guī)范采集。
（五）標(biāo)本包裝。
標(biāo)本采集后在生物安全二級實驗室生物安全柜內(nèi)分裝。
1．所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰
緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。
2．將密閉后的標(biāo)本裝入密封袋，每袋限一份標(biāo)本。樣本包裝要求要符合《危險
品航空安全運輸技術(shù)細(xì)則》相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。3. 涉及外部標(biāo)本運輸?shù)�，�?yīng)根據(jù)標(biāo)本類型，按照 A 類或 B 類感染性物質(zhì)進(jìn)行三
層包裝。
（六）標(biāo)本保存。
用于病毒分離和核酸檢測的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測，能在 24 小時內(nèi)檢測的標(biāo)
本可置于 4℃保存；24 小時內(nèi)無法檢測的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存（如無
-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。血清可在 4℃存放 3 天，-20℃以下可長
期保存。應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为毐４鏄?biāo)本。標(biāo)本運送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。
（七）標(biāo)本送檢。
標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送往實驗室，如果需要長途運輸，建議采用干冰等制冷方
式進(jìn)行保藏。
1．上送標(biāo)本
各�。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）聚集性病例的標(biāo)本，上送中國疾病預(yù)防控制中心病
毒病預(yù)防控制所進(jìn)行檢測復(fù)核，并附樣本送檢單（見附表）。
2．病原體及標(biāo)本運輸
2.1 國內(nèi)運輸
新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于 A 類，對
應(yīng)的聯(lián)合國編號為 UN2814，包裝符合國際民航組織文件 Doc9284《危險品航空
安全運輸技術(shù)細(xì)則》的 PI602 分類包裝要求；環(huán)境樣本屬于 B 類，對應(yīng)的聯(lián)合國
編號為 UN3373，包裝符合國際民航組織文件 Doc9284《危險品航空安全運輸技
術(shù)細(xì)則》的 PI650 分類包裝要求；通過其他交通工具運輸?shù)目蓞⒄找陨蠘?biāo)準(zhǔn)包裝。
新型冠狀病毒毒株或其它潛在感染性材料運輸應(yīng)按照《可感染人類的高致病
性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（原衛(wèi)生部令第 45 號）辦理《準(zhǔn)運證書》。
2.2 國際運輸
新型冠狀病毒毒株或樣本在國際間運輸?shù)�，�?yīng)規(guī)范包裝，按照《出入境特殊
物品衛(wèi)生檢疫管理規(guī)定》辦理相關(guān)手續(xù)，并滿足相關(guān)國家和國際相關(guān)要求。
2.3 毒株和樣本管理
新型冠狀病毒毒株及其樣本應(yīng)由專人管理，準(zhǔn)確記錄毒株和樣本的來源、種
類、數(shù)量，編號登記，采取有效措施確保毒株和樣本的安全，嚴(yán)防發(fā)生誤用、惡
意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。
二、新型冠狀病毒的實驗室檢測
新型冠狀病毒感染的常規(guī)檢測方法為實時熒光 RT-PCR。任何新型冠狀病毒
的檢測都必須在具備條件的實驗室由經(jīng)過相關(guān)技術(shù)安全培訓(xùn)的人員進(jìn)行操作。本
指南中的核酸檢測方法主要針對新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框 1ab（open
reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。
實驗室確認(rèn)陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個：
1. 同一份標(biāo)本中新型冠狀病毒 2 個靶標(biāo)（ORF1ab、N）實時熒光 RT-PCR 檢測結(jié)
果均為陽性。如果出現(xiàn)單個靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測。
如果仍然為單靶標(biāo)陽性，判定為陽性。
2. 兩種標(biāo)本實時熒光 RT-PCR 同時出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性，或同種類型標(biāo)本兩次采樣檢
測中均出現(xiàn)單個靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果，可判定為陽性。
核酸檢測結(jié)果陰性不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的
因素，包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過
晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。
三、實時熒光 RT-PCR 方法檢測新型冠狀病毒核酸
（一）目的。
規(guī)范實時熒光 RT-PCR 方法檢測新型冠狀病毒核酸的工作程序，保證實驗結(jié)
果的正確可靠。
（二）范圍。
適用于實時熒光 RT-PCR 方法檢測新型冠狀病毒核酸。
（三）職責(zé)。
檢測人員：負(fù)責(zé)按照本檢測細(xì)則對被檢樣本進(jìn)行檢測。
復(fù)核人員：負(fù)責(zé)對檢測操作是否規(guī)范以及檢測結(jié)果是否準(zhǔn)
確進(jìn)行復(fù)核。
部門負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)對科室綜合管理和檢測報告的審核。
（四）樣本接收和準(zhǔn)備。
核對被檢樣本姓名、性別、年齡、編號及檢測項目等；待檢樣本的狀態(tài)如有
異常，需注明；待檢樣本應(yīng)存放于-70℃冰箱保存。
（五）檢測項目。
1.新型冠狀病毒核酸測定（實時熒光 RT-PCR 方法）推薦選用針對新型冠狀病毒
的 ORF1ab、N 基因區(qū)域的引物和探針。
靶標(biāo)一（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶標(biāo)二（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
核酸提取和實時熒光 RT-PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考相關(guān)廠家試劑盒說明。
2.結(jié)果判斷
陰性:無 Ct 值或 Ct≥40。
陽性：Ct 值<37，可報告為陽性。
灰度區(qū)：Ct 值在 37-40 之間，建議重復(fù)實驗，若重做結(jié)果 Ct 值<40，擴(kuò)增曲線有
明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。
注：如果用的是商品化試劑盒，則以廠家提供的說明書為準(zhǔn)。
四、病原生物安全實驗活動要求
根據(jù)目前掌握的新型冠狀病毒的生物學(xué)特點、流行病學(xué)特征、臨床資料等信
息，該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進(jìn)行管理，具
體要求如下：
（一）病毒培養(yǎng)。
病毒培養(yǎng)是指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、
病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組實驗等操作。
上述操作應(yīng)當(dāng)在生物安全三級實驗室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。使用病毒培養(yǎng)物
提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)等同級別的實驗室和防護(hù)條
件下進(jìn)行，裂解劑或滅活劑加入后可比照未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的防護(hù)等級進(jìn)行操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當(dāng)報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委批準(zhǔn)，取得開展相應(yīng)活
動的資質(zhì)。
（二）動物感染實驗。
動物感染實驗是指以活病毒感染動物、感染動物取樣、感染性樣本處理和檢
測、感染動物特殊檢查、感染動物排泄物處理等實驗操作，應(yīng)當(dāng)在生物安全三級
實驗室的生物安全柜內(nèi)操作。實驗室開展相關(guān)活動前，應(yīng)當(dāng)報經(jīng)國家衛(wèi)生健康委
批準(zhǔn)，取得開展相應(yīng)活動的資質(zhì)。
（三）未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作。
未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作是指未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方
法滅活前進(jìn)行的病毒抗原檢測、血清學(xué)檢測、核酸提取、生化分析，以及臨床樣
本的滅活等操作，應(yīng)當(dāng)在生物安全二級實驗室進(jìn)行，同時采用生物安全三級實驗
室的個人防護(hù)。
（四）滅活材料的操作。
感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測、抗原檢測、
血清學(xué)檢測、生化分析等操作應(yīng)當(dāng)在生物安全二級實驗室進(jìn)行。分子克隆等不含
致病性活病毒的其他操作，可以在生物安全一級實驗室進(jìn)行。
附表
新型冠狀病毒檢測標(biāo)本送檢表
送樣單位（蓋章）： 送樣日期： 年 月 日
送樣人：
標(biāo)本 編號
標(biāo)本類型 姓名 性別 年齡 發(fā)病日期 就診日期 采樣日期樣本來源是否為聚集性病例
§檢測日期
實時熒光 RT-PCR 基因序列同源性*
備注
試劑廠家 靶基因 一代 深度測序基因序列同源性*非必選項，注明完成具體靶基
因序列/全基因組序列，及其與新型冠狀病毒的同源性。樣本來源是否為聚集性病
例§填是或否。
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